产品货号：
WE0231
中文名称：
DNA文库定量试剂盒(Illumina平台)
英文名称：
NGS Library Quantification Kit for Illumina
产品规格：
1ml|5ml
发货周期：
1～3天
产品价格：
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本制品是采用染料法（SYBR Green I）对NGS建库后的产物进行实时荧光定量PCR（qPCR）。试剂盒提供了qPCR过程所需的反应混合液，DNA引物混合物，标准品，试剂体系完整，操作简单方便。本试剂盒使用的是一种经化学修饰的全新高效热启动聚合酶，酶的激活需在95℃下孵育10min。该产品特异性强，扩增效率高，能够对构建的文库浓度进行快速准确的定量。适用于无需ROX作为校正染料的荧光定量PCR仪，如RocheLightCycler 480，Roche LightCyler 96，Bio-radiCyleriQ，iQ5，CFX96。
本制品是针对Illumina平台二代测序文库浓度绝对定量而设计。文库末端包含Illumina P5和P7芯片结合序列，长度不超过1kb，浓度不低于0.002 pM即可使用本制品进行定量实验。试剂盒提供的qPCR Primer Mix中包含如下两种引物序列：
Primer 1:5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GA-3'
Primer 2:5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA-3'
可预先通过引物序列确认文库是否可以被该引物对扩增。
| 组分 | 1mL | 5mL |
| 2×SYBR qPCR Master Mix | 1mL | 5×1mL |
| qPCR Primer Mix | 100μL | 5×100μL |
| DNA Standard 1 | 100μL | 5×100μL |
| DNA Standard 2 | 100μL | 5×100μL |
| DNA Standard 3 | 100μL | 5×100μL |
| DNA Standard 4 | 100μL | 5×100μL |
| DNA Standard 5 | 100μL | 5×100μL |
| 50×High ROX | 40μL | 200μL |
保存：-20℃，避免反复冻融，有效期1年。
ROX染料用于校正定量PCR仪孔与孔之间产生的荧光信号误差，一般用于ABI、Stratagene等公司的Real Time PCR扩增仪。不同仪器的激发光学系统有所不同，因此ROX染料的浓度必须与相应的荧光定量PCR仪相匹配。
- 不需要ROX校正的仪器：Roche LightCycler 480，Roche LightCyler 96，Bio-rad iCyler iQ，iQ5，CFX96等。
- 需要Low ROX校正的仪器：ABI Prism7500/7500 Fast，QuantStudio 3 System，QuantStudio 5 System，QuantStudio 6 Flex System，QuantStudio 7 Flex System，ViiA 7 system，Stratagene Mx3000/Mx3005P，Corbett Rotor Gene 3000等。
- 需要High ROX校正的仪器：ABI Prism7000/7300/7700/7900，Eppendorf，ABI Step One/Step One Plus等。
- 在试验前，应详细阅读本说明。应由具备专业经验或经培训合格的人员进行操作。
- 使用请上下颠倒轻轻混匀，尽量避免起泡，并经短暂离心后使用。
- 避免反复冻融本制品，反复冻融可能使产品性能下降。
- 配制反应液时，请使用新的或者无污染的枪头和离心管，尽量防止污染。
- 扩增模板准备
将待检测文库样品用TE（10mM Tris-Cl，pH8.0，1mM EDTA）稀释，稀释后浓度尽量在0.01-20 pM之间。4℃冰上放置备用。 - qPCR反应体系配制
配制前预先将所需的冷冻保存试剂完全融化并多次颠倒混匀，然后短暂离心后备用。20μL的基础反应体系如下：
说明：成分 用量 2×SYBR qPCR Master Mix 10μL qPCR Primer Mix 0.8μL Template 4μL ddH2O 5.2μL
High Rox机型：每50μL反应体系加入1μL High Rox；
Low Rox机型：每500μL反应体系加入1μL High Rox。
根据需要配出足够量的反应体系混合物，混匀后按每孔16μL体积加入至反应孔中，空白对照加入同样体积的TE，再将准备好的标准品和稀释的样品加入至对应反应孔中，加入量为4μL/孔。推荐使用20μL反应体系，如需进行更小体系反应，将体系各组分等比减少即可。 - qPCR反应程序
注：步骤 温度 时间 循环数 预变性 95℃ 10min 1 变性 95℃ 10sec 40 退火/延伸 62℃ 30sec 溶解曲线分析65～95℃ - 退火温度请以60～64℃作为设定范围的参考，发生非特异性反应时，可提高退火温度。
- 如文库平均长度大于700bp，应适量增加退火/延伸时间。
- 退火温度请以60～64℃作为设定范围的参考，发生非特异性反应时，可提高退火温度。
- 标准曲线制作
使用有效范围内的Ct值绘制标准曲线。标准曲线相关系数R2应不低于0.99，斜率应位于-3.1与-3.6之间，如标准曲线参数不合理，建议重复实验。DNA Standard名称 DNA Standard浓度 DNA Standard 1 20 pM DNA Standard 2 2 pM DNA Standard 3 0.2 pM DNA Standard 4 0.02 pM DNA Standard 5 0.002 pM - 文库浓度计算
实验三个复孔间的Ct差异应不超过0.2，否则需删除无效数据或重复实验，请勿使用标准曲线有效Ct范围外的Ct计算稀释文库的浓度。具体文库浓度计算方法请参见本制品的数据处理Excel。
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