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DNA文库定量试剂盒(Illumina平台)图片
产品货号:
WE0231
中文名称:
DNA文库定量试剂盒(Illumina平台)
英文名称:
NGS Library Quantification Kit for Illumina
产品规格:
1ml|5ml
发货周期:
1~3天
产品价格:
询价

本制品是采用染料法(SYBR Green I)对NGS建库后的产物进行实时荧光定量PCR(qPCR)。试剂盒提供了qPCR过程所需的反应混合液,DNA引物混合物,标准品,试剂体系完整,操作简单方便。本试剂盒使用的是一种经化学修饰的全新高效热启动聚合酶,酶的激活需在95℃下孵育10min。该产品特异性强,扩增效率高,能够对构建的文库浓度进行快速准确的定量。适用于无需ROX作为校正染料的荧光定量PCR仪,如RocheLightCycler 480,Roche LightCyler 96,Bio-radiCyleriQ,iQ5,CFX96。




本制品是针对Illumina平台二代测序文库浓度绝对定量而设计。文库末端包含Illumina P5和P7芯片结合序列,长度不超过1kb,浓度不低于0.002 pM即可使用本制品进行定量实验。试剂盒提供的qPCR Primer Mix中包含如下两种引物序列:
Primer 1:5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GA-3'
Primer 2:5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA-3'
可预先通过引物序列确认文库是否可以被该引物对扩增。


组分1mL5mL
2×SYBR qPCR Master Mix1mL5×1mL
qPCR Primer Mix100μL5×100μL
DNA Standard 1100μL5×100μL
DNA Standard 2100μL5×100μL
DNA Standard 3100μL5×100μL
DNA Standard 4100μL5×100μL
DNA Standard 5100μL5×100μL
50×High ROX40μL200μL

保存:-20℃,避免反复冻融,有效期1年。


ROX染料用于校正定量PCR仪孔与孔之间产生的荧光信号误差,一般用于ABI、Stratagene等公司的Real Time PCR扩增仪。不同仪器的激发光学系统有所不同,因此ROX染料的浓度必须与相应的荧光定量PCR仪相匹配。
  • 不需要ROX校正的仪器:Roche LightCycler 480,Roche LightCyler 96,Bio-rad iCyler iQ,iQ5,CFX96等。
  • 需要Low ROX校正的仪器:ABI Prism7500/7500 Fast,QuantStudio 3 System,QuantStudio 5 System,QuantStudio 6 Flex System,QuantStudio 7 Flex System,ViiA 7 system,Stratagene Mx3000/Mx3005P,Corbett Rotor Gene 3000等。
  • 需要High ROX校正的仪器:ABI Prism7000/7300/7700/7900,Eppendorf,ABI Step One/Step One Plus等。
注:High Rox和Low Rox的配制方法见使用方法2中说明。


  • 在试验前,应详细阅读本说明。应由具备专业经验或经培训合格的人员进行操作。
  • 使用请上下颠倒轻轻混匀,尽量避免起泡,并经短暂离心后使用。
  • 避免反复冻融本制品,反复冻融可能使产品性能下降。
  • 配制反应液时,请使用新的或者无污染的枪头和离心管,尽量防止污染。



  • 扩增模板准备
    将待检测文库样品用TE(10mM Tris-Cl,pH8.0,1mM EDTA)稀释,稀释后浓度尽量在0.01-20 pM之间。4℃冰上放置备用。
  • qPCR反应体系配制
    配制前预先将所需的冷冻保存试剂完全融化并多次颠倒混匀,然后短暂离心后备用。20μL的基础反应体系如下:
    成分用量
    2×SYBR qPCR Master Mix10μL
    qPCR Primer Mix0.8μL
    Template4μL
    ddH2O5.2μL
    说明:
    High Rox机型:每50μL反应体系加入1μL High Rox;
    Low Rox机型:每500μL反应体系加入1μL High Rox。
    根据需要配出足够量的反应体系混合物,混匀后按每孔16μL体积加入至反应孔中,空白对照加入同样体积的TE,再将准备好的标准品和稀释的样品加入至对应反应孔中,加入量为4μL/孔。推荐使用20μL反应体系,如需进行更小体系反应,将体系各组分等比减少即可。
  • qPCR反应程序
    步骤温度时间循环数
    预变性95℃10min1
    变性95℃10sec40
    退火/延伸62℃30sec
    溶解曲线分析65~95℃
    注:
    • 退火温度请以60~64℃作为设定范围的参考,发生非特异性反应时,可提高退火温度。
    • 如文库平均长度大于700bp,应适量增加退火/延伸时间。



  • 标准曲线制作
    使用有效范围内的Ct值绘制标准曲线。标准曲线相关系数R2应不低于0.99,斜率应位于-3.1与-3.6之间,如标准曲线参数不合理,建议重复实验。
    DNA Standard名称DNA Standard浓度
    DNA Standard 120 pM
    DNA Standard 22 pM
    DNA Standard 30.2 pM
    DNA Standard 40.02 pM
    DNA Standard 50.002 pM

  • 文库浓度计算
    实验三个复孔间的Ct差异应不超过0.2,否则需删除无效数据或重复实验,请勿使用标准曲线有效Ct范围外的Ct计算稀释文库的浓度。具体文库浓度计算方法请参见本制品的数据处理Excel。

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